1 細胞的復蘇

【概述】

 復蘇細胞要求快速融化的手段，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化。避免 由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損害。 

【用品】 培養液、吸管、離心管、培養瓶 

【步驟】

[1] 打開水浴鍋，將溫度調至 37 ℃；

[2] 從液氮中取出凍存的細胞株，用鑷子夾住凍存管（戴防護面罩），迅速置入 37 ℃的 水浴鍋中，不斷振搖凍存管，使之盡快融化，要在 1-2 min 內完成復溫；

[3] *融化后，取出凍存管，移至超凈工作臺，用 75%酒精擦洗消毒，用無菌吸管吸取 細胞懸液移至無菌離心管，加 10 倍的含 10%胎牛血清的培養液，用吸管輕輕吹勻；

[4] 細胞懸液離心，1000rpm，5-8min，小心棄上清液。加入適量含 10%胎牛血清的培養 液，接種于培養瓶中，置于 37℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養； 

[5] 次日更換培養基，以后按常規培養方法進行培養。如果復蘇時細胞密度較高及時傳代。細胞復蘇時細胞密度以 5×105 個/ml。

2 細胞的傳代 

【概述】 培養細胞傳代根據不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼 壁生長但粘附不牢固的細胞也可以用直接吹打傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離 心沉淀后再分離傳代，或直接用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。 

【用品】 PBS（或 Hanks 液）、0.25%胰蛋白酶（或含 EDTA）、培養液、吸管、培養瓶 

【步驟】 貼壁細胞消化傳代法：

[1] 用無菌吸管吸棄瓶內舊的培養基； 

[2] 用 PBS 洗二遍，以防止殘留培養液中的血清對胰蛋白酶的抑制作用，向瓶內加入 0.5--0.8 ml 胰蛋白酶（以 25cm2），輕輕搖動培養瓶，使胰蛋白酶流遍所有的細胞表面；加入的消化液適量，因為消化液過多對細胞有損傷，同時也需要較多的含血清培養液 去中和； 

[3] 消化最好在 37℃培養箱或室溫 25℃以上的環境下進行消化，消化 2--5 min 后，把培 養瓶放在顯微鏡下觀察，發現胞質回縮、細胞間隙增大，細胞變圓后，立即將培養瓶 立起并加入少許含血清的培養液，終止消化； 

[4] 用無菌吸管反復吹打瓶壁細胞，吹打過程按順序進行，從培養瓶底部一邊開始到另一 邊結束，以確保所有底部都被吹打到；吹打過程中動作要輕柔，盡可能不要出現泡沫， 這些都損傷細胞； 

[5] 加入新鮮含 10%胎牛血清的培養液，然后將原培養瓶中的細胞懸液吸出，分別接種在 新的培養瓶中。懸浮細胞的傳代：因為懸浮生長細胞不貼壁，故傳代時不用采用消化法，可直接傳代或 離心收集細胞后傳代。直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清洗掉 1/2—2/3，然 后用吸管吹打形成細胞懸液后，再傳代。懸浮細胞多采用離心方法傳代，即將細胞連同培養液一并轉移到離心管內，離心 800—1000r/min，5min，然后去除上清，加新的培養液到離心管內，用吸管吹打使之形成細 胞懸液，然后傳代接種。部分貼壁生長的細胞，不經消化處理直接吹打也可使細胞從壁上脫落下來，而進行傳代。但這種方法僅限于部分貼壁不牢的細胞，如 Hela 細胞等。直接吹打對細胞損傷較大，導致較 大數量的細胞丟失，因此絕大部分貼壁生長的細胞均需消化后，才能吹打傳代。

 3 細胞的凍存 

【概述】 凍存細胞時要緩慢冷凍。因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍時，細胞內外的 水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應。首先細胞脫水使局部電解質 濃度增高，pH 值改變，部分蛋白質由于上述因素而變性，引起細胞內部空間結構紊亂，細胞 內冰晶的形成和細胞膜系統上蛋白質、酶的變性，引起溶酶體膜的損傷使溶解酶釋放造成細 胞內結構成分的破壞，線粒體腫脹、功能喪失并造成細胞能力代謝的障礙。胞膜上的類脂蛋 白復合體在冷凍中易發生破壞引起胞膜通透性的改變、使細胞內容物喪失。細胞核內 DNA 也是冷凍時細胞易受損部分。如細胞內冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造 成 DNA 的空間構型發生不可逆的損傷性變化，而引起細胞的死亡。在細胞凍存時要盡可能的均勻地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成是減少細胞損 傷的關鍵。目前多采用甘油或者二甲基亞砜作為保護劑。這兩種物質在深低溫冷凍后對細胞 無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透 性；加上緩慢冷凍方法可使細胞內的水分滲出細胞外，在胞外形成冰晶，減少細胞內冰晶的 形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。 

【用品】 胰酶、含血清培養基、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（667.83kPa 蒸汽高壓消毒）、 吸管、離心管、凍存管 

【步驟】

[1] 用無菌吸管吸棄瓶內舊的培養基；

[2] 加入少量 PBS 沖洗二遍， 用胰蛋白酶把單層細胞消化下來，依據傳代的方法把細胞 懸液收集于離心管中，離心 1000 rpm，5-8 min； 

[3] 小心棄上清液，加入配置好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，然后將含有 細胞的凍存液轉移到無菌的凍存管中，每個凍存管加液 1-1.5 ml，細胞最終密度為 （5—10）×106 /ml； 

[4] 凍存管封口，做好標記，按照以下程序凍存：4℃，15min- 20 min,﹣20℃ 30min- 40 min，見細胞懸液結凍后，放入﹣80 ℃冰箱 3h 或過夜，之后置于液氮中。 

【注意事項】 

[1] 從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存，但最好選擇對 數生長期細胞，已經長滿的細胞凍存復蘇后生存率很低。在凍存前一天最好換 1 次培 養液。 

[2] 將標記好并裝入凍存管的支架，從液氮容器口緩緩放入，按 1℃/ min 的降溫速度， 在 30-40min 時間內使其到達液氮表面。再停 30min 后，直接投入液氮中。 

[3] 細胞在凍存后要在短期內復蘇 1 次，觀察細胞對凍存的適應性。 

4 細胞的計數 

【概述】 細胞計數法是細胞培養研究中的一項基本技術，它是了解培養細胞生長狀態，測定培養 基、血清、藥物等物質生物學作用的重要手段。常用的細胞技術有血球計數板計數法和電子 細胞計數儀計數法。 

【用品】 血球計數板、吸管、胰酶、培養液、顯微鏡 

【步驟】

[1] 準備計數板：用無水乙醇或 95%乙醇清潔計數板和蓋玻片，待干燥后，把蓋玻片覆在 計數板上面，使之微微移向一側，露出計數板臺面少許； 

[2] 用移液槍在計數板上蓋玻片的一側加微量細胞懸液，加樣時不要溢出蓋玻片也不能溢 入兩側的玻璃槽內，如果產生上述情況需對計數板沖洗和拭干后重新加樣，加樣量也 不要過少或帶氣泡； 

[3] 在顯微鏡下，用 10×物鏡觀察，可見細胞均勻分散計數板各處。計算四角大方格內 的細胞數，壓中線者只計算左線和上線者，右線和下線不計算在內(即僅計算壓兩個 邊的細胞)，成團細胞按單個細胞計算。按照下面公式計算細胞密度：(細胞懸液的細胞數)/ml＝(四個大格子細胞數/4) ×稀釋倍數×104

【注意事項】 

[1] 消化單層細胞時，務求細胞分散良好，制成單細胞懸液。否則會影響細胞計數結果。 

[2] 取樣計數前，應充分混勻細胞懸液。在連續取樣計數時，尤其要注意這一點。否則， 前后計數結果會有很大的誤差。 

[3] 鏡下計數時，遇見 2 個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算。如細胞團 10%以 上，說明消化不充分；或細胞數少于 2 個/mm2或多于 50 個/mm2時，說明稀釋不當， 需重新制備細胞懸液、計數。 

5 培養細胞的運輸

裝運細胞的方法有兩種，一種為冷凍儲存運輸，即利用特殊容器內盛液氮或干冰凍存， 保存效果較好，但較麻煩，且不宜長時間運輸，多需空運。另一種簡單的方法為充液法，步 驟如下：[1] 選擇生長狀態良好的細胞，可直接根據路程時間來選擇接種細胞數量，一般以長滿 1/3—1/2 瓶底壁為宜，去掉舊培養液，補充新的培養液到達瓶頸部，保留微量空氣， 擰緊瓶蓋，瓶口用膠帶密封。[2] 妥善包裝運送，并用棉花等做防震防壓處理。4—5 天可以到達目的地者一般放在貼身 口袋即可，到達目的地后倒出多余的培養液，僅保留維持細胞生長所需液量。37℃培 養，次日傳代。[3] 如果距離很近，如在統一城市內或數小時路程，也可將細胞附著面朝上，或把培養液 全部倒掉放在胸部口袋進行運送。僅靠附著于細胞表面的培養液，可使細胞短時間不 致受損。6 多藥耐藥細胞的培養 多藥耐藥（Multidrug Resistance, MDR）是指腫瘤細胞長期接觸某一化療藥物，不僅對 此種化療藥物產生耐藥性，而且對其他結構和功能不同的抗腫瘤藥物也產生交叉耐藥性的現 象，是造成化療失敗的主要原因。耐藥指數（RF）=某種藥物針對抗藥性細胞的 IC50/某種藥物針對敏感性細胞的 IC50。逆轉指數（reverse index, RI）=不加逆轉劑時某種藥物針對抗藥性細胞的 IC50/加入逆 轉劑后某種藥物針對抗藥性細胞的 IC50。體外低濃度梯度遞增聯合大劑量間斷沖擊方法誘導腫瘤細胞對特定細胞產生耐藥性。第二節 細胞培養污染的檢測和排除 組織培養細胞被有害物污染是組織培養工作的大敵。應用組織培養進行研究工作，除需 要好的實驗設計和技術方法外，成敗的關鍵還在于能否避免污染。一項好的研究,或建成的滿 意細胞系，往往由于遭受污染而前功盡棄。因此，一個組織培養工作者,要始終注意防止污染。培養細胞被污染，人們最注意的是真菌、細菌和病毒等微生物。現在看來已經不夠，當 前“污染”一詞的概念應該是，凡混入培養環境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異 物，都應視為污染。從這一概念考慮，組織培養污染應包括以下幾個方面：微生物：真菌、細菌、支原體和病毒 化學物質：影響細胞生存的非細胞所需的化學成分 細尤為多見，化學污染較少；但近年隨細胞種類增多,不同種細 胞交叉污染卻屢有發生，以致在 ATCC 接受入庫細胞中特設同工酶檢測一項，目的在于證明 是否有 HeLa 等細胞的交叉污染。但細胞交叉污染只要工作細心，是容易防止的，而微生物 污染在實際工作中卻是最難防止和易發生的。 

1 污染途徑 

各種污染主要通過以下途徑和媒介發生：

[1] 空氣 

空氣是擴散微生物的主要途徑。由于空氣流動性大，在操作場地與外界隔離不嚴 和消毒不充分的情況下，外界不潔空氣很容易侵入造成污染。因此，培養設施不宜置于通風 場所?，F各實驗室普遍應用凈化工作臺，能產生無菌的屏障氣流，可防止不潔空氣污染。凈 化工作臺使用過久，過濾層受塵埃堵塞情況下，工作時不帶口罩或外界氣流過強、污染空氣 均可進入操作野，導致污染。又不同季節和不同地區空氣內含菌數不同；炎熱夏季尤其南方 多雨地區空氣濕度大、含菌數量多，工作應特別注意。空氣是不斷流動的；雖用消毒措施也 難以排出空氣中所有微生物，但每立方米內含菌數不應超過 1--5 個。

[2] 器材 

培養器皿和容器洗刷不凈殘留污物、培養用液滅菌不*等，都可引入有害物。 

[3] 操作 

實驗操作馬虎、動作不準確、消毒觀念不強，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口時不嚴，都可發生污染。同時培養兩種以上細胞，操作不慎，使用同一吸管或 用液，可能導致細胞交叉污染。

[4] 血清 

血清也是污染細胞的來源，有的市售血清制備水平低、檢測不嚴，常已被支原體 和病毒污染。 

[5] 組織 

初代培養組織常有污染；有的是在手術中污染，有的本身可能是被污染的組織(如 已經發生潰爛的腫瘤組織)；手術用碘酒消毒后，擦拭不凈可能混入碘污染。

2 污染對細胞的影響 

體外培養細胞 

[1] 細胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素 D 或雙抗都于事無補，建議舍棄該污染細胞， 將環境*消毒。無菌室經甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時即可進 入操作。 

[2] 細菌污染 

較常見的污染細菌有大腸桿菌、假單孢菌，白色葡萄菌等。細菌污染后大多 能改變培養液 pH 使培養液變混濁，也有的對培養液無肉眼可見影響，只在鏡下觀察發現菌 體時才能感知污染。細菌增殖迅速，能消耗營養液和產生毒素抑制細胞生長，毒性大的細菌 很快導致細胞崩解死亡。加用抗生素的培養用液一般可預防和排除個別少量細菌的污染。一 旦發生細菌污染很易發現，多數情況下培養液短期內顏色變黃，出現明顯污濁現象。細菌和霉菌污染多在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生。而且由于增生迅速，多 在發生污染 48h 以內就已明顯。因此在實驗的最初兩天密切觀察實驗樣本是否有污染發生， 這樣可及時采取措施予以補救或排除。 

[3] 支原體污染 

支原體是細胞培養中最常見、不易被察覺和干擾實驗結果的一種污染。從 1952--1972 年間，有人檢查了 54 個實驗室的 9700 個各類培養細胞時發現，有 11%的細胞受 到了支原體的污染。當前隨實驗室設備的改善和技術方法的改進，支原體污染率有所下降， 但尚未能*杜絕，污染仍時有發生。支原體污染是細胞培養研究室重點預防對象。支原體是一種介于細菌和病毒之間的目前所知能獨立生活的最小微生物，它無細胞壁， 形態呈高度多樣性，最小的直徑 0.2 微米，可通過濾菌器。支原體大小介于 0.2～2 微米之間， 約有 1%可通過濾菌器，因此往往難以發現。支原體形態多變，有圓形、絲狀或梨形：光鏡下 難以看清其結構。支原體多吸附于細胞表面或散在細胞之間，橫斷面很像細胞微絨毛的橫斷 面。不同支原體的生物學性狀有很大差別。所有支原體都需要固醇，部分需要精氨酸，有的 需氧、葡萄糖，有的有 DNA 酶活性、溶血作用和凝集作用;有的缺乏或全無某一特性，因此 支原體對培養細胞的影響是多方面的。大多數支原體適于偏堿條件下生存(pH7.6--8.0)，對酸 耐受性差，對熱比較敏感;對青霉素普遍有抗藥性；青霉素作用主要抑制細菌細胞壁的形成， 支原體無細胞壁，故不受影響。細胞受支原體污染后，個別嚴重情況下，加之細胞敏感，可 使細胞增殖緩慢、部分細胞變圓、從瓶壁脫落。但多數細胞受污染后，無明顯變化，或有微 細變化卻由于傳代和換液而被緩解。在觀察不夠細心和缺乏經驗時，外觀上往往給人以“正常” 的感覺，實則污染細胞會受到多方面潛在的影響。 

[4] 細胞交叉污染 

細胞培養中，細胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養操作過程中各 種細胞同時進行，混雜使用所用器具或液體所致，這種污染能使細胞的生長特性、形態特征 等發生變化，有些變化較輕微、不易察覺，有些則可能由于污染的細胞具有生長優勢最終壓 過原來細胞而導致細胞的生長抑制，最終死亡。常用觀察細胞形態、分析生長特性和核型、 檢測細胞的標記物等方法檢測交叉污染的細胞。 

3 污染的檢測 

[1] 細菌、真菌污染的檢測 

肉眼觀察 細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生，而且增生迅 速，若有污染，在 48 小時內可明顯觀察到，例如培養液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂 起。接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可發現是否有污染。鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污 染。若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌污染。

[2] 支原體污染的檢測 

相差顯微鏡觀察 直接取少許培養液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈 暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現。應注意與細胞破 碎溢出的內容物如線粒體等相區別。熒光染色法觀察 用熒光染料 Hoechst33258，此染料能與 DNA 特異地結合，可使支原 體內的 DNA 著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。電鏡檢測 若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養 48～72 小時， 細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。培養檢測 將細胞懸液 5mL 加入 45mL 支原體肉湯培養基，培養 14 天后觀察肉湯培養 有無霧狀沉淀，然后取 0.5ml 加入已冷卻到 50℃的培養基中，再用瓊脂培養基做分離培養， 37℃培養 3 天觀察有無“荷包蛋”菌落出現。 

[3] 病毒的檢測 

應用電鏡技術快速診斷動物病毒病。逆轉錄_聚合酶鏈反應 RT-PCR 檢測病毒。 

4 污染的預防 

防止污染，預防是關鍵，預防措施應貫穿于整個細胞培養的始終。培養細胞 的污染一旦明確，多數將無法救治，如果污染的細胞不是具有重要的價值，一般發現污染后 應盡快棄之，以防污染擴大影響其他細胞。因此，應盡力預防污染的發生。防止的關鍵在嚴 格無菌操作，把好每一關口，盡可能禁止其他污染的物品進入培養操作環節。

[1] 器皿準備中的預防 

用于細胞培養的器皿應嚴格清洗，做到真正潔凈；應該無菌的物品， 要做到消毒嚴格，真正無菌；器皿在運輸、貯藏過程中，要嚴格操作，謹防污染。

[2] 開始操作前的預防 

主要包括以下方面：應當按廠家規定，定期清洗或更換超凈工作臺 的空氣濾網，請專職人員定期檢查超凈工作臺的空氣凈化標準；檢查培養器皿是否有消毒標 志，有條件的實驗室應盡可能使用一次性無菌器皿；檢查新配制的培養液，確認無菌方可應 用；操作前提前半小時啟動超凈工作臺及紫外消毒燈；操作者應消毒雙手和戴口罩。

[3] 操作過程中的預防 

主要包括：在超凈工作臺面放置的所有培養瓶瓶口不能與超凈工作 臺的風向相逆，不允許用手觸及器皿的無菌部分，如瓶口和瓶塞內側；在安裝吸管帽、開啟 或封閉瓶口操作時要經過火焰燒灼，并在火焰附近工作；吸取培養液、細胞懸液等液體時， 應專管專用，防止污染擴大或造成培養物之間的交叉污染；使用培養液前，不宜過早開瓶；開瓶后的培養液應保持斜位，避免直立；不再使用的培養液應立即封閉瓶口；培養的細胞在 處理之前勿過早暴露于空氣中；操作時不要交談、咳嗽，以防唾沫和呼出氣流引發污染；操 作完畢后應將工作面整理好，并消毒擦拭工作面，關閉超凈工作臺。

[4] 其他方面的預防 

主要有：為了確保培養物的安全，應及早凍存有價值的培養物；購入 的未滅活血清應采取 56℃水浴滅活 30 分鐘的措施以使血清中的補體和支原體滅活；對新引 進的細胞株應加強觀察，防止外來的污染源；超凈臺的風機不能過大，風機到 6-8 格。否則 也可能能致霉菌污染；孵箱應定期清潔（2 月左右），尤其在多雨的季節，培養箱清洗方法是：用 84 液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用 自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用 3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者 0.5％過氧乙酸擦 拭。 

5 污染的排除 

培養的細胞一旦被微生物污染，應及時處理，防止其他細胞被污染。通常選 高壓滅菌被污染的細胞，然后棄掉。如果有價值的細胞被污染，并且污染程度比較輕，可通 過及時排除污染物，挽救細胞恢復正常。常用的排除微生物污染方法有如下幾種：

[1] 抗生素排除法 

抗生素是細胞培養中殺滅微生物的主要手段。各種抗生素性質不同，對 各種微生物的作用也不同，聯合應用比單用效果好，預防性應用比污染后使用好；如果發生 微生物污染后再使用抗生素，常難以去掉。有的抗生素對細菌僅有抑制作用，而無殺滅效應。反復使用抗生素還能使微生物產生耐藥性，且對細胞本身也有一定影響，因此有人主張盡量 不用抗生素處理，當然，一些有價值的細胞被污染后，仍需用抗生素挽救，在這種情況下， 可采用 5～10 倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用 24--48 小時，再換入常規培養 液。有時可能奏效。抗生素的參考用量和效果列于表。表 常用抗生素及推薦用量 抗生素 抗菌譜 常用濃度 細菌 真菌 支原體 青霉素 鏈霉素 慶大霉素 四環素 卡那霉素 兩性霉素 制霉菌素 G+ GG+/GG+/GG+/G- + + + + + 100IU/ml 100μg/ml 200μg/ml 10μg/ml 50μg/ml 2μg/ml 25μg/ml

[2] 加溫除菌 

根據支原體耐熱性能差的特點。有人將受支原體污染的細胞置于 41℃中作用 5～10 小時(最長可達 18 小時)以殺滅支原體。但 41℃對培養細胞本身也有較大影響，故在處 理前，應先進行預試驗，確定出最大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。

[3] 動物體內接種 

受微生物污染的腫瘤細胞可接種在同種動物皮下或腹腔，借動物體內免 疫系統消滅污染的微生物，腫瘤細胞卻能在體內繼續生長，待一定時間后，從體內取出再進 行培養繁殖。 

[4] 與巨噬細胞共培養 

在良好的體外培養條件下巨噬細胞可存活 7--10 天，并可分泌一些細 胞生長因子支持其他細胞的克隆生長。與體內的情況相似，巨噬細胞在體外培養條件下仍然 可吞噬微生物并將其消化。利用 96 孔培養板將極少量的培養細胞與巨噬細胞共培養，可以在 高度稀釋培養細胞、極大地降低微生物污染程度的同時，更有效地發揮巨噬細胞清除污染的 效能。本方法與抗生素聯合應用效果更佳。